每年一度的流感疫苗竞赛和试剂的作用

2020 年 8 月 17 日疾病洞察力、免疫测定、流感、服务、疫苗

在这篇博客中，我们解释如何开发、制造和验证季节性和大流行性流感疫苗，并介绍我们的合同服务以实现快速开发

流感病毒：快速回顾

流感病毒是属于正粘病毒科的单链 RNA 病毒，通常直径为 80-120 纳米，呈球形或呈丝状。流感的基因组包含八个单链 RNA，包裹在蛋白质衣壳中，被脂质双层包围，血凝素 (HA)、神经氨酸酶 (NA) 和基质 (M1、M2) 蛋白质从脂质双层中突出。正粘病毒科包括四种主要类型的流感病毒 (A–D)，按其 NA 和 M1 蛋白分类；临床上最相关的是共同传播的甲型和乙型流感病毒。到目前为止，对于 A 型流感，至少已识别出 16 种高度可变的 HA (H1-18) 和 9 种不同的 NA (N1-11) [1]； B 型流感病毒具有与 A 型相似的病毒结构，但缺少 H/N 亚型。

流感病毒感染（称为流感）每年都会爆发不同程度的严重程度，周期为 of 高峰发病率（称为流感季节）在北半球和南半球之间按季节波动 [2]。流感感染通常会影响上呼吸道，症状较轻，包括发烧、头痛和不适。然而，即使是普通的流感，对其他方面健康的人来说也可能很严重，对年老体弱的人来说也是致命的，并会引发肺炎、器官衰竭和继发感染等并发症。据估计，季节性流感每年在全世界造成 10 亿感染和 290,000-650,000 人死亡 [3]。

标有关键蛋白的流感病毒横截面。血凝素识别细胞- 表面受体并介导细胞进入；神经氨酸酶裂解神经氨酸（唾液酸）残基以促进病毒后代的释放；基质 1 介导膜复合物的组装并赋予结构完整性；基质 2 是调节病毒 pH 值的选择性质子通道；核蛋白（未显示）结合 8 条 ssRNA 链并介导包装、运输、转录和复制。

流感病毒可以说是最成功的地方性和大流行性人类病毒之一病原体。这在很大程度上可以归因于它们的宿主多样性和变异能力。除了是具有快速产生遗传变异的先天能力的 RNA 病毒外，流感病毒还特别擅长进行重大的基因组变化以逃避适应性免疫反应的识别。流感通过抗原漂移和转变的有效组合实现了这一巨大效果：抗原漂移是一个持续的过程，在这个过程中，宿主产生适应性免疫，为流感的血凝素蛋白突变产生选择压力 [4]。由于 HA 包含各种结构耐受区域，流感 RNA 聚合酶缺乏校对活性，因此 HA 突变可以迅速积累。这使得 HA 的表位能够快速改变并逃避宿主识别，而不会阻碍流感病毒进入细胞的能力。

另一方面，抗原转变的特征是通过基因组重排机智突然改变 HA 和 NAh 当两种不同的流感病毒共同感染同一细胞时出现的其他流感亚型。这可能导致高度有利的功能获得性突变，赋予病毒新的疾病特征或宿主嗜性。虽然所有流感病毒都会发生抗原漂移，但只有甲型流感病毒能够发生抗原漂移，因为它们具有广泛的动物宿主，提供了病毒多样性以促进此类事件。通过如此剧烈地改变其表面抗原的表位，甲型流感毒株能够使免疫系统完全措手不及，并在人群中迅速增殖。事实上，最具破坏性的人类流感流行，包括 1918 年西班牙流感、1968 年香港流感、2004 年禽流感和 2009 年猪流感，都是人类/非人类甲型流感病毒株重组的结果 [5] .

针对移动目标接种疫苗

为了预防季节性流感和大流行性流感，各种 c采取了对策，包括社区警报、抗病毒药物、个人防护设备和筛查。然而，毫无疑问，控制流感最有效的方法是广泛使用预防性疫苗，这不仅可以减少传播，还可以限制感染的严重程度，尤其是在儿童或老人等高危人群中。流感疫苗开发的设计策略基于这样的理解，即 HA 的头部——尤其是其环区——是中和抗体反应的最有效目标，因为它们的暴露和在发病机制中的作用。然而，考虑到这些免疫原性环也是 HA 最不保守的区域，除了通过重组可能出现新的 HA 亚型之外，新开发的疫苗永远面临快速淘汰的威胁。

甲型流感 H1N1 血凝素蛋白胞外域，头部区域为浅蓝色，茎部区域为深蓝色（PDB：4GXX）。

因此，新型流感疫苗必须每半年配制一次，以应对北半球和南半球即将到来的流感季节。这些配方中的一种是由世界卫生组织 (WHO) 领导的，其全球流感监测和反应系统 (GISRS) 由大约 150 个全球实验室组成，监测流感的传播，并旨在预测新毒株的出现。这些实验室统称为国家流感中心 (NIC)，每年检测超过 200 万份呼吸道标本，进行初级病毒分离和初步抗原鉴定，并指导工具的开发和解释，以预测季节性和新出现的人畜共患菌株。一旦从确诊患者身上提取分离物，它们就会被运送到 WHO 专业实验室，即 WHO 合作中心 (CC)，进行更高水平的抗原和遗传分析——其结果构成了疫苗成分建议的基础 [6]。

显示 2020 年 1 月 NIC 流感监测数据的地图。转载自世界卫生组织，流感更新 359 [7]。

在 135 个流感季节和 3 次大流行之后，GISRS 继续代表全球公共卫生合作的模范平台。季节性流感的全年监测不仅是 bedrock 的季节性疫苗，但有助于应对新出现的流行病，因为早期预警有助于减轻疫情的后果并保持现有疫苗的功效。然而，预测未来的传播并非易事，它是基于消息灵通但仍然容易出错的猜测。因此，季节性配方并不总是与主要菌株相匹配，导致只有小程度的交叉保护和显着较低的功效 [8, 9]。例如，2014/15 流感季导致全球死亡人数激增，这在很大程度上归因于疫苗与流行的 H3N2 毒株之间的差异，导致疫苗的有效性仅为 19% [10]。

流感疫苗开发的第二个主要警告是大规模生产疫苗所需的缓慢且资源昂贵的制造过程。大多数灭活 (IIV) 和减毒流感疫苗 (AIV) 是使用数百万个受精鸡蛋生产的吃正在收获并组合以产生三价或四价制剂的菌株。然后将标准剂量装入小瓶、注射器或喷雾剂的容器中进行给药。由于这个过程从头到尾通常需要 6-8 个月，因此大多数疫苗在公开提供时都已经半过时了 [5]。对于大流行性疫苗，情况类似：一旦发现大爆发，多家制造商竞相生产候选疫苗，随之而来的是一场争夺战。制造季节性疫苗的弊端与 2009 年毁灭性的 H1N1 猪流感流行证明了这一点，据估计延迟疫苗接种导致数十万人额外死亡 [11, 12]。

为了克服这些限制，正在开发各种重组的下一代疫苗平台，这些平台具有更保守的表位，这些表位扩展了现有制剂的菌株特异性。具体而言，正在开发平台以保护针对一个亚型（例如所有 H1 毒株）和多个亚型（例如 H1/H5/H9）中的所有毒株，最终目标是创造一种真正的\"通用”泛流感 A/B 疫苗，可以引发终身免疫 [13] .这种疫苗的好处是显而易见的：由于流感仍然是唯一需要每年接种疫苗的人类疾病，据估计，仅用通用疫苗替换 10% 的季节性疫苗就可以避免 6,300 例与流感相关的死亡，并节省 10 亿美元仅在美国，每年的直接医疗保健费用就达 1 美元 [14]。

但是，通用疫苗的开发并非没有挑战。到目前为止，现有候选疫苗提供的交叉保护范围仅限于小群亚型，不会刺激真正的异型保护 [15]。此外，考虑到季节性疫苗赋予的免疫力在大约 6 个月后会减弱 [16]，目前尚不清楚通用疫苗如何发挥作用生病赋予持久的保护。因此，在可预见的未来，传统的流感疫苗可能会继续存在，并需要 GISRS 继续进行监测和预测工作。

验证瓶颈

鉴于严格的时间表需要流感疫苗的开发、制造和分销受制于独特的监管流程，需要公共卫生当局、疫苗制造商和监管机构之间进行密切沟通。

说明流感疫苗开发关键阶段的时间表。*并非所有国家/地区都进行了临床试验。改编来自世界卫生组织的大流行性流感疫苗生产过程和时间表 [17]。

开发流程的一个关键阶段是疫苗的验证，评估疫苗在动物和动物体内诱导特异性抗体反应的能力几十年来，这是使用血凝素抑制测定 (HAI) 和单径向溶血测定 (SRH) 进行的，以确定接种疫苗的血清是否符合严格的预定义标准。然而，最近的研究表明，人类对流感产生了非常广泛的免疫反应，并且在随后受到新毒株的挑战时，预先存在的流感特异性 B 细胞和 T 细胞反应性会对个体的能力产生积极或消极的影响中和病毒[18]。因此，很明显，HAI 和 SRH 测量不一定是最有用的，并且未针对新平台进行优化，从而导致采用更多样化的方法，允许使用更广泛的基于证据的端点 [19]。

如今，酶联免疫吸附测定 (ELISA) [20] 和抗原微阵列 [21] 等平台是流行的血清学分析方法，因为它们能够定性和定量地确定对疫苗接种的体液反应并将其与自然反应进行比较感染。这些测试对于评估无法包含在比较中的极端年龄的人的反应特别有用效研究，但最需要疫苗的人群 [22]。然而，由于流感毒株及其后续疫苗随季节变化，适当的血清学检测并不容易获得，必须针对特定配方开发 [23]。此外，必须同时开发范围广泛的试剂并进行校准以用作对照，以确保足够的测定特异性。因此，检测方法的开发和用于设计它们的关键试剂可能成为验证过程中的主要瓶颈。尽管化验开发通常不会延迟疫苗的可用性，但按时生产化验每年都面临挑战，最近疫苗株数量的增加导致人们越来越担心试剂的及时可用性 [24]。

< p>现已提供合同流感服务

为支持流感疫苗开发，The Native Antigen Company 现在提供定制合同服务以快速开发高 q 组合使用我们专有的 VirtuE 表达系统的优质流感抗原，可确保完全糖基化和正确折叠。为了证明我们的能力，我们从多种流感毒株中制备了一组 HA 和 NA 蛋白，成功率超过 90%。

StrainSubtypeInfluenza A/Brisbane/02/2018H1N1Influenza A/Kansas /14/2017H3N2甲型流感/新加坡/INFIMH-16-0019/2016H3N2甲型流感/加利福尼亚/07/2009H1N1甲型流感/爱知/2/1968H3N2甲型流感/威斯康星/67/2005H3N2甲型流感/波多黎各/8 /1934H1N1甲型流感/香港/483 /97H5N1A型流感/Shanghai/2/2013H7N9A型流感/珍珠鸡/香港/WF10/99H9N2B型流感/Colorado/06/2017N/A

疫苗设计复杂化，流感病毒能够利用宿主细胞机制翻译后将 N-连接的聚糖添加到 HA 的抗原性保守结构域并保护它们免受免疫识别（称为聚糖屏蔽）[25]。因此，去除聚糖部分允许重新在疫苗配方中激活更多免疫原性表位，以增加保护的广度和程度。

H1N1 血凝素的结构，聚糖显示为空间填充价（黄色），蛋白质拓扑结构显示为网状表面（蓝色）（PDB：4UO2）。

但是，由于聚糖是蛋白质折叠和三聚化所必需的，因此通过原核表达 [26] 完成去糖基化，用衣霉素 [27] 或 PNGase F 处理消化 [28] 不是可行的策略。为了消除特定的糖基化位点，Native Antigen 公司提供了对特定天冬酰胺残基进行定点诱变的能力，同时仍然促进正确的蛋白质折叠。此外，我们还提供抗体生成和免疫测定开发服务，为您的流感研究提供进一步支持。

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参考资料

1) https://www.cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm

2) https： //www.cdc.gov/flu/season/index.html

3) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5935243/

4) https://science.sciencemag.org/content/326/5953/734

5) https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S128645791400327X?via%3Dihub

6) https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/en/

7) https://www.who.int/influenza/surveillance_monitoring/updates/2020_01_20_update_GIP_surveillance/en/

8) https://www.cdc.gov/flu/prevent/how- fluvaccine-made.htm

9) https://gcgh.grandchallenges.org/challenge/ending-pandemic-threat-grand-challenge-universal-influenza-vaccine-development

10) https://www.cdc.gov/flu/vaccines-work/effectiveness-studies.htm

11) https://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS1473- 3099(12)70121-4/fulltext

12) https://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMra1208802

13) https://jbiomedsci.biomedcentral。 com/articles/10.1186/s12929-020-0626-6

14) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31548402/

15) https:/ /www.nature.com/articles/d41586-019-02751-w

16) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28039340/

17) https://www.who.int/csr/disease/swineflu/notes/h1n1_vaccine_20090806/en/

18) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3667171/

19) https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-指南/influenza-vaccines-non-clinical-clinical-module_en.pdf

20) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29803776/

21) https ://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31403629/

22) https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/irv.12383

23) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28189147/

24) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5820418/

25) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24638204/

26) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19822741/

27) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2738090/

28) https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24469815/

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